Egyszerű családban, Jane Lampton Clemens és John Marshall Clemens ötödik gyermekeként látta meg a napvilágot. A család igyekezett tisztes egzisztenciát teremteni, de az idők folyamán egyre jobban elszegényedtek, 1842-ben egyetlen rabszolgájukat, Jennyt is el kellett adniuk. Amikor Samuel 13 éves volt, meghalt édesapja. A fiú a Missouri Courier-nál kezdett dolgozni, Orion nevű bátyja pedig megvette a Hannibal Journal című lapot. Ebben jelent meg Samuel első rövid cikke. 18 éves koráig Samuel a családjával Hannibalban, egy Mississippi-parti községben élt. Eleinte a bátyja újságjánál dolgozott, majd később San Franciscóban a Morning Call-nál és a Californian-nál. 1852-től utazó tudósítóként több cikket írt a bátyja lapjának Philadelphiából, New Yorkból és Washingtonból. 1855-től Clemens St-Lousiban élt, és egy folyami gőzhajón dolgozott. 1857-ben elkezdte az ez irányú képesítés megszerzését, 1859-ben sikerrel végzett. 1861-ben tagja lett a helybeli szabadkőműves páholynak. Az amerikai polgárháború kitörése 1861-ben a munkanélküliséget hozta el számára. Két hetes katonáskodás után, melyet a Missouri State Guard-nál töltött, Orion fivérével együtt Nyugatra indult és Nevadában aranyásóként dolgoztak. Mivel nem jártak sikerrel, 1862-ben visszatért az újságíráshoz, ezúttal a nevadai Virginia City Territorial Enterprise riportereként. 

A Mark Twain álnevet először 1863. február 3-án használta. (Az álnév a hajósnyelvből jön és a mélységmérő rúdon a második vonást jelenti. Hajósinasként gyakran kiabálta hátra az orrban mért vízmélységet.) 1864-ben Twain San Franciscóba költözött, majd ismét Nevadába, vissza Kaliforniába, Hawaiiba és megint Nevadába. Közben rövid ideig tudósítóként dolgozott Európában és a Közel-Keleten. A szélesebb körű elismerést az 1865-ben megjelent Jim Smiley and His Jumping Frog történet hozta meg. Ezután profi előadóként járta az országot és New York-i lapoknak kezdett írni. 1870-ben feleségül vette Olivia Langdont. 1871-ben Hartfordban (Connecticut) telepedett le, ahol 17 évig élt sikeres íróként. Közvetlen szomszédja Harriet Beecher Stowe volt, aki komoly hatást gyakorolt az írónak a rabszolgaságról vallott nézeteire. Ebben a korszakban jelentek meg legjobb művei: Tom Sawyer kalandjai, Élet a Mississippin és a Huckleberry Finn kalandjai. 1874-ben Mark Twain egy Remington -írógépet vásárolt és a Tom Sawyer kalandjai volt az első olyan könyv a világon, amelynek a kéziratát az író írógéppel készítette. 1891-ben ismét Európába utazott, ahol kilenc évet maradt. Első üzleti próbálkozása 1869-ben történt, amikor részesedést szerzett a Buffalo Express lapban. A saját könyvei mellett anyagi sikert jelentett a Charles L. Webster & Co. könyvkiadó, amely Ulysses S. Grant tábornok (később elnök) életrajzát adta ki. 1894-ben egy nyomdai vállalkozása csődbe jutott, ezért az anyagi ügyeinek a rendbehozatalára felolvasó körútra indult. Az utazás alatt meghalt Twain Suzy nevű lánya. Twain szerencséjére a Standard Oil alelnöke, Henry Huttleston Rogers, kész volt Twaint átsegíteni az anyagi nehézségeken. Twain négy gyermeke közül három idő előtt halt meg; feleségét is elvesztette. Mark Twain 1910-ben ünnepelt hírességként hunyt el. Életműve sok amerikai íróra hatással volt. Hemingway mondta róla: Az egész amerikai irodalom Mark Twain egyetlen könyvéből ered, a Huckleberry Finn-ből … Előtte semmi sem volt. Azóta sem írtak ilyen jót.